如何检测短寿命自由基？ 自旋捕获电子顺磁共振方法介绍（二）

自旋捕获技术因其可实现短寿命自由基的检测，已在生物、化学等领域得到广泛应用。对于自旋捕获实验，捕获剂加入的时间、捕获剂浓度、体系溶剂、体系pH等诸多因素均会影响实验结果。因此针对不同的自由基，需合理选择捕获剂、合理设计实验方案，从而达到较佳实验结果。 捕获剂及溶剂选择 常见的O-中心自由基有羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧。 ·羟基自由基（∙OH） 对于羟基自由基，通常在水溶液中进行检测，使用DMPO进行捕获，其与DMPO形成的加成物半衰期为几分钟至数十分钟。 ·超氧阴离子自由基（∙O2-） 对于超氧阴离子自由基，若选择DMPO作为捕获剂，则需要在甲醇体系中进行检测。这是因为水和DMPO的结合能力高于超氧自由基与DMPO的结合能力，如果在水中检测超氧自由基，水跟DMPO的结合速度会大于超氧自由基与DMPO的结合速度，从而导致超氧自由基不容易被捕获到。当然，如果超氧自由基的产生量很多，也可能会被DMPO捕获。如果想在水溶液中捕获超氧自由基，则需要选择BMPO作为捕获剂，因为BMPO在水溶液中捕获超氧自由基形成的加成物半衰期可到数分钟。 ·单线态（1O2） 对于单线态氧检测，通常选用TEMP作为捕获剂，其检测原理如图1所示，单线态氧可将TEMP氧化，形成含有单电子的TEMPO自由基，从而被电子顺磁共振波谱仪检测。由于TEMP易被氧化，易产生背景信号，因此检测单线态氧之前需先对TEMP进行测试，作为对照实验。 图1 TEMP检测单线态氧的机理 表1常见的O-中心自由基检测捕获剂及溶剂选择 捕获剂的加入时间 在光催化反应中，当光照射催化剂时，价带电子会激发到导带上，产生电子/空穴对。其中，光生空穴具有强的得电子能力，可以夺取催化剂表面吸附的水或羟基，从而生成∙OH。这类实验一般需要在光照前加入捕获剂，结合原位光照系统，可以研究自由基信号随光照时间的变化，如图2所示，随着光照时间的不同，生成的∙OH含量不同。 图2 国仪量子原位光照实验结果 在升温反应中，如果反应温度低于捕获剂的耐受温度，则可在反应前加入捕获剂。如果反应温度高于捕获剂的耐受温度，则需在反应后加入捕获剂迅速取样。 自由基检测及注意事项 （1）DMPO捕获自由基形成的加合物寿命一般较短，对于生成速率慢且需要长时间积累的化学反应，可选用BMPO作为捕获剂，如BMPO与∙OH形成的加成产物寿命可达数日，因此可连续捕获，对信号进行累积。 （2）DMPO作为捕获剂时，在不同的氧化环境中其自身会发生重组或分解。此时可通过降低催化剂浓度、改变体系pH、快速取样测试等方法避免。 图3 不同环境中DMPO自氧化产物的EPR谱 （数据由国仪量子EPR系列产品测试） （3）为了准确判断生成的自由基种类，可通过化学手段消除自由基，从而对结果进行二次验证。如对于∙OH，乙醇、DMSO等都是∙OH的清除剂，可加入这些清除剂，从而对∙OH进行进一步验证。如图4所示，加入乙醇后，∙OH信号强度变低，出现CH3∙CHOH信号。对于超氧阴离子自由基，可通过加入超氧化物歧化酶（SOD）进行二次验证。 图4 使用乙醇清除∙OH进行二次验证 （数据由国仪量子EPR系列产品测试所得） 国仪量子连续波电子顺磁共振波谱仪 国仪量子电子顺磁共振波谱仪搭配原位光照系统、高/低温系统、电化学系统，可用于研究各类顺磁性分子，比如有机自由基、金属配合物、掺杂材料、缺陷材料、金属蛋白等，可满足多场景自由基检测需求。